行業(yè)動態(tài)
阿維菌素類藥物酶聯(lián)免疫試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
本品系用阿維菌素藥物偶聯(lián)蛋白的抗原、阿維菌素類藥物多克隆抗體和酶標(biāo)記羊抗兔及其它試劑制成。用于定量、定性檢測牛組織中阿維菌素類藥物的殘留量。
【物理性狀】 試劑盒外觀完整，內(nèi)裝試劑齊全。包被抗原的酶聯(lián)板透明干燥且用真空包裝。阿維菌素類藥物抗體工作液、底物液、終止液、阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液為透明溶液，酶標(biāo)記物為淺黃色溶液，試劑無菌檢驗均應(yīng)合格。
【靈敏度測定】 取已包被好的酶標(biāo)板12孔，每兩孔分別加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液各20µL，再加入抗體工作液80µL，用蓋板膜蓋板，37℃環(huán)境中反應(yīng)30min，取出用洗滌液按每孔250μL，洗板4－5次，每次浸泡10秒，用吸水紙拍干，加入100µL酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30 min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50µL，避光37℃反應(yīng)15 min，用50µL終止液終止反應(yīng)，置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值（B）平均值除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以AVM濃度（µg/L）的自然對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
IC50（即0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值50％處所對應(yīng)的AVM濃度）范圍應(yīng)在2.32µg/L ~4.57µg/L之間。
【特異性測定】 取已包被好的酶標(biāo)板18孔，每兩孔分別加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液和牛肉樣品提取液、20µg/L和50µg/L兩個濃度阿維菌素添加的牛肉樣本提取液各20µL，再加入抗體工作液80µL，37℃反應(yīng)30min，取出洗板5次，拍干，加入100µL酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)15 min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50µL，避光37℃反應(yīng)15 min，用50µL終止液終止反應(yīng)，置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值（B）平均值除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以AVM濃度（µg/L）的自然對數(shù)為X軸，百分吸光度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出陰性樣品和20µg/L和 50µg/L兩個濃度阿維菌素添加的組織樣品的測定濃度。
陰性樣品測定值在3µg/L以下，以20µg/kg 和50µg/kg 兩個濃度阿維菌素樣本進(jìn)行添加，回收率應(yīng)在60.0%~120.0％以上。
【精密度測定】 取已包被好的酶標(biāo)板32孔，每兩孔分別加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液20µL，其它20孔加入4.5µg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液20µL，再加入抗體工作液80µL，37℃反應(yīng)30min，取出洗板5次，拍干，加入100µL酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30 min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50µL，避光37℃反應(yīng)15 min，用50µL終止液終止反應(yīng)，置450nm波長處測定吸光度值。
20個微孔的4.5µg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的光吸收值變異系數(shù)（%）應(yīng)≤25%（n=20）
【適用范圍】 用于定量、定性檢測牛組織（肌肉、肝臟）中阿維菌素類藥物的殘留量。
【用法和結(jié)果判定】
1. 溶液配制
1.1 稀釋復(fù)溶液：將2X濃縮復(fù)溶液搖勻，用水以1：2比例稀釋，臨用前配制。
1.2 稀釋洗滌液：將20X濃縮洗滌液搖勻，用水以1：20比例稀釋，臨用前配制。
2. 樣品前處理
2.1 牛組織（牛肉、牛肝）樣本處理方法
2.1.1 取牛組織（肌肉、肝臟）進(jìn)行均質(zhì)。
2.1.2 稱取2±0.05g樣品，加入8mL乙腈，振蕩提取20min，3000g以上離心10min，取上清液5mL備用。
2.1.3 取sep-pak vac12cc(2g)柱，稱取3g無水硫酸鈉平鋪在濾板上，加入10mL乙腈溶液。
2.1.4 加入提取液5mL，收集濾液，待提取液流干，再加入4mL乙腈清洗殘留液。
2.1.5 將收集濾液置60℃下氮氣吹干，加入1mL稀釋了的復(fù)溶液復(fù)溶。
2.1.6 取20µL進(jìn)行分析。
3. 檢測步驟
3.1 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20~24℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
3.2 取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃不要冷凍。
3.3 編號：將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均需做2孔。
3.4 用加樣器每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本20mL 后，每孔再加80mL抗體溶液。
3.5 用蓋板膜蓋板后置于37℃環(huán)境反應(yīng)30min。
3.6 小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液每孔250mL充分洗滌4~5次，每次間隔10~20s，用吸水紙拍干。
3.7 加酶標(biāo)記物：每孔加入100mL。用蓋板膜蓋板后置37℃環(huán)境反應(yīng)30min，取出重復(fù)洗板步驟。
3.8 顯色：每孔加入底物液A液50mL，再加底物液B液50mL，輕輕振蕩混勻37℃環(huán)境避光顯色15min。
3.9 測定：每孔加入終止液50mL，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測），測定每孔OD值。
4. 結(jié)果判定
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
以阿維菌素濃度的自然對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)每一個樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。
【貯藏條件和保存期】試劑盒應(yīng)在2~8℃保存，保存期為6個月。
【規(guī)格】每個試劑盒含96孔板一塊；AVM標(biāo)準(zhǔn)品6瓶，1mL/瓶（0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L）；抗體工作液1瓶，10mL；酶標(biāo)記物工作液1瓶，12mL；20倍濃縮洗滌液1瓶，40mL；2倍濃縮復(fù)溶液1瓶，50mL；底物液A液1瓶，7mL；底物液B液1瓶，7mL；終止液1瓶，7mL；高濃度標(biāo)準(zhǔn)品（1µg/mL）1瓶，1mL；蓋板膜1張；自封袋1個；說明書1份；質(zhì)量報告1份。
【注意事項】
1、劑盒在緩沖液配制和液體分裝上要做到無菌，防止試劑變質(zhì)。
2、試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格配制后方可用于試劑盒中。
3、添加回收用的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品需經(jīng)過試劑盒自身標(biāo)準(zhǔn)驗證，合格后方可用于特異性和準(zhǔn)確度監(jiān)控用。
4、嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所述用法和結(jié)果判定內(nèi)容進(jìn)行試劑盒質(zhì)量控制。
5、在試劑盒老化實驗中出現(xiàn)有不合格現(xiàn)象，則視該批試劑盒為不合格。
